通過(guò)使用反相色譜柱，并根據(jù)不同維生素的性質(zhì)選擇合適的流動(dòng)相和梯度洗脫程序，可以實(shí)現(xiàn)有效的分離。所得結(jié)果的重現(xiàn)性好，精密度高，加標(biāo)回收率通常在85%～110%之間。
在實(shí)際應(yīng)用中，不同樣品的前處理對(duì)于色譜柱的保護(hù)和結(jié)果的準(zhǔn)確性至關(guān)重要。例如，脂溶性維生素的樣品可能需要經(jīng)過(guò)皂化處理后提取至有機(jī)溶劑中，而水溶性維生素的樣品則可能需要經(jīng)過(guò)酶處理或酸堿處理以改善其在色譜柱中的分離效果。
此外，高效液相色譜法還可以實(shí)現(xiàn)維生素各個(gè)異構(gòu)體的很好分離，并且可以同時(shí)對(duì)多種維生素進(jìn)行有效分析，大大提高了檢測(cè)效率。這使得HPLC在維生素檢測(cè)中具有廣闊的應(yīng)用前景。
工作原理
高效液相色譜法（HPLC）是一種用于分離、鑒定和定量液體樣本中的半揮發(fā)和不揮發(fā)化合物的分析技術(shù)。它的工作原理基于色譜法的分離原理，即不同物質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間的分配平衡。在HPLC中，流動(dòng)相是攜帶待測(cè)組分通過(guò)色譜柱的液體，而固定相則是色譜柱中的填料，它固定在色譜柱中并起到吸附和解析組分的作用。流動(dòng)相和固定相的選擇對(duì)于HPLC的分離效果至關(guān)重要。
流程概述
1. 樣品前處理
樣品制備：首先需要對(duì)樣品進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶幚?，如縮分、粉碎或均質(zhì)化，然后避光冷藏保存。
皂化：對(duì)于某些維生素，如維生素A和維生素E，需要進(jìn)行皂化處理。這通常涉及將固體樣品或液體樣品與氫氧化鉀等堿性溶液反應(yīng)，以釋放出維生素。
提?。菏紫刃枰獙悠分械木S生素從其生物基質(zhì)中提取出來(lái)。這通常涉及到使用適當(dāng)?shù)娜軇?，如乙醇、甲醇或水，有時(shí)還需要加入抗氧化劑以防止維生素降解。
凈化：提取液可能含有許多干擾物質(zhì)，因此需要通過(guò)固相萃取（Solid Phase Extraction, SPE）等方法進(jìn)行凈化，以去除雜質(zhì)，提高維生素的純度。
濃縮與稀釋：根據(jù)檢測(cè)需要，可能需要對(duì)提取液進(jìn)行濃縮或進(jìn)一步稀釋，以達(dá)到合適的濃度范圍。
2. 樣品制備
過(guò)濾：使用0.45μm的濾膜過(guò)濾樣品溶液，以去除任何可能堵塞HPLC系統(tǒng)的顆粒物。
進(jìn)樣：將處理后的樣品溶液轉(zhuǎn)移到HPLC的自動(dòng)進(jìn)樣器中，準(zhǔn)備進(jìn)行分析。
3. HPLC分析
選擇合適的色譜柱：根據(jù)目標(biāo)維生素的性質(zhì)，選擇適合的反相或正相色譜柱。
設(shè)定流動(dòng)相：流動(dòng)相的選擇取決于目標(biāo)維生素的極性和溶解性，通常包括水、甲醇、乙腈等，并可能添加酸、鹽或緩沖液來(lái)調(diào)整pH值和離子強(qiáng)度。
優(yōu)化色譜條件：包括流速、溫度、梯度洗脫程序等，以獲得最佳的分離效果。
檢測(cè)：使用紫外-可見(jiàn)光檢測(cè)器（UV-Vis）、熒光檢測(cè)器或電化學(xué)檢測(cè)器等，根據(jù)維生素的特性選擇最敏感的檢測(cè)方式。
4. 數(shù)據(jù)分析
峰識(shí)別：通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間對(duì)比，確認(rèn)每個(gè)峰代表的維生素種類。
定量分析：使用外標(biāo)法或內(nèi)標(biāo)法，根據(jù)峰面積或峰高計(jì)算維生素的含量。
5. 結(jié)果驗(yàn)證
重復(fù)性測(cè)試：多次測(cè)量同一樣品，評(píng)估方法的重復(fù)性和準(zhǔn)確性。
回收率實(shí)驗(yàn)：通過(guò)向已知含量的樣品中添加一定量的標(biāo)準(zhǔn)維生素，再進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算回收率，驗(yàn)證方法的可靠性。
注意事項(xiàng)
在整個(gè)過(guò)程中，應(yīng)嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)環(huán)境，避免維生素的氧化或降解。
每次分析前后，都要對(duì)色譜系統(tǒng)進(jìn)行徹底清洗，以防止交叉污染。
根據(jù)具體維生素的性質(zhì)，可能需要調(diào)整上述流程中的某些步驟，例如使用特定的前處理方法或檢測(cè)條件。
根據(jù)維生素的性質(zhì)選擇合適的流動(dòng)相和梯度洗脫程序
選擇合適的流動(dòng)相
流動(dòng)相的選擇對(duì)于維生素的分離效果至關(guān)重要。對(duì)于水溶性維生素，通常選擇含有一定比例的水和有機(jī)溶劑（如甲醇或乙腈）的混合溶液作為流動(dòng)相。例如，在分析維生素C時(shí)，可以使用0.1 mol·L^-1醋酸鈉溶液和甲醇的混合溶液作為流動(dòng)相。對(duì)于脂溶性維生素，流動(dòng)相通常包含更高比例的有機(jī)溶劑，以增強(qiáng)其在流動(dòng)相中的溶解度。
設(shè)計(jì)梯度洗脫程序
梯度洗脫程序是通過(guò)改變流動(dòng)相的組成比例，從而實(shí)現(xiàn)不同維生素的有效分離。梯度洗脫程序通常包括起始條件、梯度變化階段和終止條件。例如，在分析復(fù)合維生素注射液中的11種維生素時(shí)，可以采用以下梯度洗脫程序：起始時(shí)流動(dòng)相為95%醋酸鈉溶液和5%甲醇，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后逐漸減少醋酸鈉溶液的比例，增加甲醇的比例，直至全部為甲醇，然后再恢復(fù)到起始條件。
注意事項(xiàng)
在設(shè)計(jì)流動(dòng)相和梯度洗脫程序時(shí)，需要考慮維生素的化學(xué)性質(zhì)、穩(wěn)定性以及色譜柱的特性。此外，還需要根據(jù)實(shí)際樣品的復(fù)雜程度和分析目的來(lái)調(diào)整流動(dòng)相的組成和梯度洗脫的細(xì)節(jié)。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，可能需要多次優(yōu)化才能獲得滿意的分離效果。
技術(shù)優(yōu)勢(shì)
高速分析：HPLC的分析速度快，通?？梢栽趲追昼姷綆资昼妰?nèi)完成分析，這對(duì)于需要快速得到結(jié)果的場(chǎng)合非常適用。
高分辨率：HPLC能夠有效地將復(fù)雜混合物中的各個(gè)組分進(jìn)行分離，尤其是對(duì)于分子量相近、結(jié)構(gòu)相似的化合物，HPLC展現(xiàn)出良好的分離能力。
高靈敏度：HPLC的檢測(cè)器如紫外-可見(jiàn)光檢測(cè)器、熒光檢測(cè)器等具有非常高的靈敏度，能夠檢測(cè)到非常低濃度的樣品組分。
廣泛的適用性：HPLC幾乎可以用于所有可溶性的有機(jī)化合物的分析，包括高沸點(diǎn)、不易揮發(fā)的、熱穩(wěn)定性差的以及具有生理活性的物質(zhì)。
重復(fù)性好：HPLC系統(tǒng)具有高度的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，只要操作條件控制得當(dāng)，多次分析同一樣品時(shí)，色譜圖幾乎相同。
自動(dòng)化程度高：現(xiàn)代的HPLC系統(tǒng)已經(jīng)高度自動(dòng)化，包括自動(dòng)進(jìn)樣、自動(dòng)梯度洗脫、自動(dòng)數(shù)據(jù)處理等功能，大大減輕了操作人員的勞動(dòng)強(qiáng)度，提高了分析效率。
樣品消耗少：HPLC的進(jìn)樣量通常很小，一般在幾微升到幾十微升之間，這對(duì)于珍貴樣品的分析尤為重要。
柱后衍生化：HPLC系統(tǒng)可以與柱后衍生化技術(shù)結(jié)合，對(duì)不易檢測(cè)的化合物進(jìn)行衍生化，轉(zhuǎn)化為易于檢測(cè)的化合物，從而擴(kuò)大了HPLC的檢測(cè)范圍。
